Растенок - все о здоровье детей и будующих мам.
ГлавнаяНовостиКонтакты
 

Морфологические исследования в детской онкологии

Морфологические исследования в детской онкологии
Значение роли морфолога в онкологической клинике трудно переоценить. Особенно возросла и усложнилась она за последние годы. Развивающиеся быстрыми темпами методы молекулярной биологии, приведшие к открытию онкогенов и генов-супрессоров, потребовали интеграции результатов молекулярных исследований при постановке почти любого микроскопического диагноза. Пока, безусловно, остаются в силе традиционно используемые критерии диагностики патологической анатомии, однако, вне всякого сомнения, будущее за новым направлением в онкоморфологии, где, вероятно, на передний план выступят не структурные особенности опухолевого процесса, а экспрессия специфических генов, так называемый «молекулярный портрет» новообразованной ткани. Следует подчеркнуть, что сказанное ни в коей мере не исключает необходимости соблюдения алгоритма обработки и изучения материала в ежедневной практике патологоанатомических отделений, а, наоборот, в определенной мере усложняет требования к качеству проводимых процедур, поскольку осуществление иммуногистохимических и молекулярно-генетических исследований предъявляет повышенные требования к сохранности клеток и внутриклеточных компонентов — ДНК, РНК и белков.

В общих чертах патологоанатом в процессе совместной работы с клиницистом должен выяснить нозологическую специфичность процесса, определить степень зрелости опухолевой ткани и клеток, помочь в установлении распространенности болезни, выявить возможные признаки прогностического плана и параметры, на основании которых можно подобрать адекватный вид терапии, и, наконец, оценить эффект проведенного лечения — терапевтический патоморфоз.

Процесс морфологической верификации диагноза начинается с проведения биопсии.


Существует неправильная установка на эту процедуру, как на нечто очень простое и рутинное. На самом деле практика показывает, что репрезентативность полученного при биопсии материала в большинстве случаев чрезвычайно низка. При этом существует другое заблуждение, основанное на том, что большинство врачей судит о будущей информативности биопсии по размерам удаляемого участка, в то время как зачастую этот признак от размера материала не зависит. Крупные куски могут не содержать патогно-моничных участков, а небольшие обрывки могут быть представлены достаточным числом диагностически достоверных клеточных структур. Поэтому проведению биопсии должен предшествовать тщательный анализ изучаемого процесса с точки зрения его возможной гетерогенности, зональности, изменения во времени и т. д. Например, при биопсировании новообразования мягких тканей с подозрением на саркому и псевдосаркоматозные заболевания всегда надо учитывать возможную зональность поражения. Следует помнить этот факт при диагностике процессов, протекающих с формированием костной ткани.


При изучении биопсированного участка оссифицирующего миозита молено допустить серьезную ошибку, не зная того обстоятельства, что центральные участки этого процесса всегда содержат незрелые элементы, а в периферических происходит их созревание. Процесс интенсивного остеогенеза можно принять за остеосаркому. Также тщательно надо сравнивать биопсированные участки костных новообразований с рентгеновскими снимками этих процессов, чтобы иметь четкое представление о том, какому участку процесса биопсия принадлежит. Для правильной интерпретации характера самой опухоли необходимо помнить и об изменении структуры опухоли в течение определенного отрезка времени. В целом ряде случаев строение опухоли, наличие или отсутствие патогномоничных структур зависит от стадии морфогенеза опухоли. Например, саркома Капоши на разных стадиях имеет разную морфологию. На ранней стадии она вообще может быть неотличима от доброкачественных ангиоматозных разрастаний.

Одной из важнейших составных частей процесса морфологической диагностики является информация о клинических особенностях болезни.


Несмотря на многократные обсуждения данной проблемы, клиницист в большинстве случаев ограничивается чрезвычайно краткими констатациями, такими как «опухоль нижней трети бедренной кости», «забрюшинная опухоль» и т. д. Однако кроме тщательной характеристики самой опухоли, ее топики, макроскопических особенностей роста, решающее значение имеют, особенно у детей, анамнестические данные, сведения о наличии семейных и наследственных случаев опухолевых заболеваний и других неопухолевых процессов у данного пациента. Число сложных, сочетанных синдромов, в состав которых входит та или иная опухолевая нозология, все время увеличивается, а описание этих синдромов, включающих разные уродства, нарушения формообразовательных процессов, системные поражения, к сожалению, в направлениях в патологоанатомическое отделение никогда не фигурирует. Например, даже такой простой симптом, как наличие кожных пигментированных участков «cafe au lait» (кофейные пятна), сочетающийся с нейрофиброматозом, в направлении фиксируется крайне редко.

Сложности выявления, например, парнеопластических гормональных синдромов заключаются в том, что их надо тщательно искать исходя из целого ряда симптомов, о которых пациенты, особенно дети, рассказать не могут. Весьма важным разделом морфологического исследования является срочное гистологическое исследование. Изучение замороженного материала с помощью современных методик дает возможность судить о характере процесса с достаточно высокой долей достоверности за короткий период в течение оперативного вмешательства. Однако следует отметить, что за последние годы число срочных исследований несколько снизилось во всем мире. Точнее, изменилась инфраструктура материала, подлежащего интраоперационному исследованию. Прежде всего, наблюдается отход от таких задач, как установление гистогенеза опухоли, решение вопроса о злокачественности процесса (особенно при опухолях молочной железы). На смену срочному исследованию приходит дооперационная core-биопсия. Зато расширилось использование замороженных срезов для установления степени распространенности процесса, проверки абластичности краев резекции и др. В любом случае, результаты этого исследования необходимо оценивать осторожно и не требовать от патолога категоричности в формулировке диагноза. Всегда надо помнить, что диагноз срочного гистологического исследования является ориентировочным диагнозом.

Определенные проблемы связаны с установлением факта наличия опухолевых клеток по линиям операционных разрезов. Совершенно недопустимо формулировать микроскопические находки фразами типа «по линии резекции имеются опухолевые клетки» и тем более на этом основании делать повторные резекции. Необходимо помнить, что возможность рецидивирования из-за нарушения абластики зависит не только от факта присутствия опухолевых клеток по линии резекции, но и от их количества. Небольшое, единичное скопление опухолевых клеток может подвергнуться элиминации в ходе репарации процесса. Считается доказанным, что опухолевые клетки в поверхностных слоях стенок полого органа (например желудка) не влияют на дальнейшее прогрессирование и рецидивы процесса, в то время как в глубоких (мышечных) слоях их наличие прогностически весьма неблагоприятно. К сожалению, не всегда патологи дискриминируют в своих ответах, где находятся опухолевые клетки — в строме органа или в просвете кровеносных или лимфатических сосудов. Основное внимание заслуживают клетки, которые находятся в тканях, вне сосудов. Материал, полученный уже после оперативного вмешательства, является основным опорным материалом для верификации окончательного диагноза. Тем более важной, иногда неоценимой, является правильная оценка макроскопических особенностей процесса.

Сделать это следует при макроскопическом изучении, описании удаленного препарата. Необходимо, чтобы описание препарата проводили совместно патолог и клиницист. Как бы детально хирург не заполнил направление на морфологическое исследование, оно никогда не заменит его живых комментариев, которые во многом проясняют морфологу не только основные особенности процесса, но и помогают выделить то множество интересных деталей, учет которых даст возможность по-новому и глубже трактовать характер поражения органа, не говоря уже о том, что в условиях опухолевого роста топографические особенности часто нарушаются и многие анатомические детали трудно выявляемы.

Трактовка микроскопической структуры опухолей у детей практически не отличается от диагностического алгоритма, применяемого при изучении новообразований у взрослых. Безусловно, детские опухоли во многом отличаются от их аналогов у недетской популяции. Во-первых, по своей инфраструктуре. Наиболее частые опухоли у детей — это лейкозы, новообразования центральной нервной системы, нейробластомы, опухоль Вилмса почки, саркомы. Одной из характерных черт детских опухолей является связь с эмбриональными структурами, граница между которыми порой трудно устанавливается: нефробластоматоз-нефробластома, гепатобластома, сиалобластома. Педиатрические опухоли склонны к спонтанному созреванию (нейробластома). Однако принципиальной разницы в диагностических подходах к детским и взрослым опухолям не существует.

До настоящего времени диагноз в онкоморфологии ставится по нозоло¬гическому принципу, хотя в последние годы основы этого принципиального подхода заметно пошатнулись. Разберем эту тенденцию на конкретном примере. Постановка такого диагноза, как гастроинтестинальная стромальная опухоль (GIST) окончательно происходит на основании обнаружения мутации в области гена c-kit на длинном плече хромосомы 4 (4ql2). Но эта мутация мо¬жет выявляться в клетках целого ряда новообразований, начиная от лейкозов и заканчивая нейрофибромой. Тогда возникает вопрос, может ли считаться нозологически GIST самостоятельным заболеванием, если единственный патогномоничный признак находится за пределами морфологического параметра? Известно, что лечение гастроинтестинальных стромальных опухолей основывается на применении таргетной терапии, назначение которой всецело зависит от наличия мутации c-kit. Таким образом, с клинических позиций предпочтительнее смешанный, морфомолекулярный, а не формально морфологический подход. Это не означает, что кончилась эра описательной традиционной морфологии. Во-первых, большинство диагнозов, именно в прикладном клинико-морфологическом аспекте, основываются на традиционно используемых дескриптивных параметрах, поэтому от них отказываться рано. Во-вторых, в настоящее время проводятся исследования с уже конкретными результатами, которые дают возможность идентифицировать эквивалентные молекулярно-генетическим находкам микроскопические признаки, которые вполне могут быть применены в ежедневной клинической деятельности. Так, удалось аппроксимировать молекулярный портрет молочной железы к нуждам патоморфологических лабораторий. При изучении геномных особенностей рака молочной железы были выделены 5 типов, имеющих определенные экспрессионные профили. Установление этих разновидностей доступно пока только единичным лабораториям в мире, однако выяснилось, что с помощью более простых методов, сочетающих традиционные микроскопические параметры и ИГХ-реакции, можно выделить группы, эквивалентные подвидам молекулярного портрета рака молочной железы.

Одним из плодотворных направлений современной морфологи является изучение клеточных взаимодействий в опухоли. Это направление исходит из допущения, что клиническое поведение опухоли, ее доброкачественность или злокачественность зависят не только от характеристик самих опухолевых клеток, а от их взаимодействия с другими, на первый взгляд, неопухолевыми клеточными элементами. Это развивающееся быстрыми темпами направление о микроокружении опухолевых клеток постепенно обрастает весьма достоверными микроскопическими данными, имеющими непосредственное прикладное диагностическое и прогностическое значение. Так, уже общепризнано значение гистиоцитарных инфильтратов в пролиферирующих лейомиомах матки, как показателя малигнизации опухоли. В педиатрической онкологии наиболее перспективными с этих позиций являются поиски морфогенетических особенностей нейробластомы. Как известно, нейробластома, одна из наиболее распространенных злокачественных опухолей у детей, в своем морфогенезе проходит несколько фаз и может вызреть в ганглионейрому. Зависит ли эта способность к повышению дифференцировки от самих нейробластов или является результатом клеточных взаимодействий — вопрос до конца не решенный, однако все больше аргументов, свидетельствующих в пользу предположения о том, что условия и микроокружение для созревания нейробласта создают клетки Шванна, число которых нарастает по мере трансформации опухоли в сторону ганглионейромы. При кажущейся однозначности этого утверждения оно требует в клиническом аспекте иного методического диагностического подхода. Необходимо в каждом конкретном случае путем специальной окраски учитывать долю стромальных, шванновских элементов и популяции нейробластов.

До сих пор клиницисты и патологоанатомы прилагают огромные усилия для нахождения параметров, которые могли бы помочь в индивидуализации прогноза опухолевого заболевания. Пока для этой цели используется понятие о степени злокачественности опухоли — grade (G), введенное в онкологию A. Broders почти 100 лет назад, в 1921 г. В изначальном виде ученый выделял 4 степени злокачественности (0, 1, 2, 3) в зависимости от числового соотношения зрелых и незрелых клеток. В последующем эта принципиальная схема подверглась детализации для разных нозологических единиц, обогатилась новыми параметрами и стала включать уже новые иммуногистохимические и молекулярно-генетические показатели.

Установление степени злокачественности требует соблюдения целого ряда условий. Во-первых, ее нельзя использовать для характеристики опухолей промежуточной степени злокачественности, например, для атипической фиброксантомы. Существуют злокачественные опухоли, которые не подлежат классификации по степеням, например, дедифференцированная липосаркома. Нельзя определять G после терапии, в том числе химиотерапия, поскольку лечение может изменить как морфологию клеток, так и митотический режим. Для установления G необходимо достаточное число срезов, поэтому следует избегать ставить G на core-биопсиях. Очень важным условием является также соблюдение режима фиксации. После неадекватной фиксации в опухолевой ткани могут не сохраняться митотические фигуры.

Тенденция последних лет — разрабатывать G для отдельных гистогенетических разновидностей, опухолей разных органов. Например, для сарком существуют две системы: Национального онкологического института в США и так называемая французская. Первая включает гистологический тип и подтип опухоли, локализацию, объем некротических участков, клеточный и ядерный полиморфизм, митотический индекс. Французская система состоит из 3 параметров: степени дифференцировки, митотического индекса и объема некротических участков.

Специальные системы разработаны для педиатрических опухолей. В онкопедиатрии главное — гистологический тип, а не степень дифференцировки опухолевых клеток. Например, все ботриоидные и веретеноклеточные рабдомисаркомы обладают высокой степенью зрелости, в то время как альвеолярная рабдомиосаркома — низкой степенью.

Специальная система предложена для нейробластомы. Самая популярная из них — классификация по Shimada. Схема включает возраст, степень дифференцировки нейробласта, наличие или отсутствие шванновской стромы (бедная или богатая стромой), модулярный характер роста, индекс митозкариорексис (соотношение митотически делящихся клеток к числу клеток, подвергающихся кариорексису, рассчитанному на 5 000 клеток). Низкий индекс — меньше 100 клеток, промежуточный — 100-199 клеток, высокий индекс — 200 клеток и более. На основании указанных параметров выделяются две группы благоприятной и неблагоприятной гистологии.

Является ли показатель степени зрелости опухоли параметром, реально отражающим прогноз злокачественного процесса? В изолированном виде — нет. При прочих равных клинико-морфологических параметрах, как один из важных показателей, — да. Тем не менее следует предостеречь от переоценки значения этого показателя в прогностическом плане. Причина этого факта кроется в следующем. На заре становления онкоморфологии было введено понятие дифференцировки — термин, используемый в нормальной гистологии для обозначения процесса постепенного нарастания разницы в морфологии между камбиальными базальными и зрелыми поверхностными элементами многослойного эпителия. «Слепой» перенос указанной аналогии в патологическую анатомию породил концептуальную ошибку, поскольку в огромном большинстве случаев источник клеточного генеза опухолей неясен. Если морфолог при оценке микроскопической структуры нейробластомы имеет точку отсчета и судит о степени зрелости опухолевых клеток в ряду нейробласт — ганглиозная клетка с помощью вполне апробированных параметров, то любые суждения о степени дифференцировки ряда круглоклеточных сарком носят умозрительный характер, поскольку клеточный источник этих опухолей пока не уточнен. То, на чем основывает патоморфолог свое заключение о степени дифференцировки опухоли (в данном случае саркомы), является, скорее, оценкой клеточного полиморфизма опухолевой клетки, а не реально произошедших в ней процессов созревания. С позиций современных достижений молекулярной биологии понятие о степени дифференцировки опухолевых клеток вообще лишается теоретического базиса. Считается доказанным, что любая клетка человека содержит полный набор генов. Разница между клетками состоит только в форме экспрессии этих генов, степени их метилирования. Деметилирование какого-нибудь гена и приводит к его активированию и синтезу целого ряда веществ, которые ответственны за развитие в клинике так называехчых паранеопластических, эктопических синдромов. Секреция адренокортикотропного гормона в опухолях легкого, хорионического гонадотропина в раке желудка и т. д. Тем не менее в клинической патологии сохраняется этот параметр, хотя его прогностическая ценность весьма относительна, и группа опухолей, для которых она в реальности может быть применена, совсем незначительна. Это, скорее всего, характеристика некой внешней структурной организации опухолевой ткани, чем показатель ее биологической сущности.

Одной из важнейших задач, выполняемых патологоанатомом в онкологической клинике, является оценка проведенного лечения, установление лечебного патоморфоза. Мнение о целесообразности и информативности получаемых при этом результатов чрезвычайно разнится, вплоть до полного отрицания значения этого параметра. Попытаемся разобрать проблемы, связанные с этой процедурой. Первое, что следует помнить как клиницисту, так и патологу, — это то, что лекарственный патоморфоз определяется в той части опухоли, которая осталась после терапии. Нередко патолог не видит никаких существенных изменений в опухолевой ткани после лечения, а клиницист доказывает, что опухоль в процессе лечения сократилась вдвое. Дело в том, что, во-первых, объем опухоли сокращается за счет резорбции реактивно-воспалительных явлений в опухоли, а во-вторых, если в процессе отмирания опухолевых клеток происходит их своевременная и быстрая элиминация за счет активности фагоцитирующих элементов, то, естественно, учитывать их количество невозхможно. Таким образом, степень терапевтического патоморфоза — это степень вторичных изменений в персистирующих структурах опухоли. Предложены самые разнообразные градации посттерапевтических изменений. Обычно они делятся на 3-4 степени. Высшая, четвертая, степень патохморфоза — это полное исчезновение опухоли на фоне воспалительно-резорбтивных изменений. В подобных случаях следует обязательно подтверждать диагноз предшествующей терапии биопсией. Также относительным понятием является патохморфоз первой степени. Дистрофические и незначительные некробиотические изменения, составляющие понятие первой степени патоморфоза, трудно отдифференцировать от неспецифических, спонтанно происходящих регрессивных явлений в опухолевой ткани. По существу, наиболее достоверными являются признаки второй и третьей степени. Вторая степень патоморфоза — это частичное исчезновение паренхимы опухоли, а при третьей степени обнаруживаются небольшие группы опухолевых клеток с выраженной воспалительно-фиброзной реакцией организма.

Принципиальным недостатком критериев терапевтического патоморфоза является невозможность уловить и регистрировать тонкие изменения на субклеточном уровне, невидимые в микроскопе, поскольку многие химиотерапевтические вещества влияют на такие ультраструктурные признаки, как конфигурация ДНК, синтез РНК и т. д. Возможно, что те грубые вторичные изменения, на которые мы опираемся при определении степени патоморфоза, не охватывают всего спектра структурных изменений, наступающих под влиянием лечения. Тот факт, что воздействие на опухолевые клетки не ограничивается только деструктивными изменениями, а может проявляться изменением определенных функций клеток, хорошо демонстрируется при применении прогестинов в процессе лечения рака эндометрия. Чувствительные опухолевые клетки начинают гиперпродукцию слизи, подвергаются эпидермизации и т. д. Необходимость других подходов к оценке терапевтического патоморфоза совершенно очевидна, особенно в связи с введением в онкологическую клинику таргетных препаратов, влияющих на еще более глубинные и тонкие регуляторные механизмы роста и деления клеток.

Огромным шагом вперед в морфологической диагностике опухолей явилось введение в патологическую анатомию методов иммуногистохимическго исследования, широкое внедрение которых стало возможным после разработки метода гибридом и наступило с начала 1980-х гг. ИГХ-исследование основывается на принципе визуализации антигенов с помощью соответствующих антител, меченных ферментами. В нашей стране обычно используются антитела, меченные пероксидазой. Нанесенное на срезы антитело связывается с антигеном и, при последующей обработке хромогеном (диаминобензидином), который вступает в реакцию с ферментной частью полученного комплекса, образуется окрашенный продукт (в данном случае коричневого цвета). По интенсивности окраски этого продукта можно судить о количестве искомого антигена и, самое главное, о его точной локализации в клетке.

Число антигенов, визуализируемых с помощью ИГХ-исследования, огромно. Применение специфических антител дает возможность открыть в клетке элементы цитоскелета (виментин, десмин, разновидности актина), продукты секреции (меланин, гормоны), компоненты мембраны и огромную группу веществ, маркеров дифференцировки — кластеров дифференцировки, характерных для целых линий клеток, особенно важных для идентификации элементов гемопоэтической направленности — диагностики разновидностей лимфом, для их иммунофенотипирования.

ИТХ-исследование стало чрезвычайно популярным и результативным. Однако одновременно наметилась тенденция, которая заключается в некоторой переоценке его значения. Причины, которые часто не учитываются при интерпретации результатов ИГХ-исследования, следующие.
1. ИГХ-реакции в подавляющем большинстве случаев проводятся на материале, который прошел фиксацию, заливку в парафин. Антигенные структуры, которые должны вступить в реакцию со специфическими антителами, в результате вышеуказанной процедуры видоизменяются и нуждаются в дальнейшем восстановлении. С этой целыо материал, препараты со срезами, дополнительно обрабатываются (в микроволновой печи, в специальных растворах, при определенной высокой температуре и т. д.), после чего они становятся пригодными для дальнейшего изучения. На данном этапе подготовки срезов можно допустить ошибку — недоработать, передержать срезы, разрушить эпитопы (локусы, вступающие в реакцию) и исказить результаты реакции, т. е. получить ложноотрицательные результаты.
2. Не все эпитопы строго и высокоспецифичны. Неспецифичные положительные реакции при ИГХ-исследовании обычны. Требуется обязательное введение в реакционную систему контрольных срезов, как положительного, так и отрицательного.
3. Наиболее важная причина ошибочных заключений кроется в абсолютизации целого ряда маркеров, выявляемых при ИГХ-исследовании. Дело в том, что за определенным антигеном, открытым в клетках определенной направленности дифференцировки, часто закрепляется ярлык маркера именно этой дифференцировки. По мере же расширения спектра применения этих антител выясняется, что этот же антиген присутствует в тканях иного гистогенеза, иногда совершенно неродственного, что затрудняет трактовку и установление тканевого и клеточного источника опухоли и приводит иногда к диагностическим ошибкам. Например, НМВ-45 — антиген, считавшийся строго специфичным для меланомы, стали выявлять в ряде опухолей почек и печени. Вначале без всякого основания эти опухоли стали диагностировать как меланомы. Только после анализа большого числа наблюдений выяснилось, что все эти новообразования гистологически принадлежали к четко очерченной группе — ангиохмиолипоме. В настоящее время уже стало рутинным выявлять признаки синтеза меланина в определенных клетках этой нозологии, что ни¬как не дает основания расценить их как меланому. Бывает и другая ситуация. Какой-нибудь антиген вначале предлагается как специфичный маркер той или иной дифференцировки. Наиболее типичный пример — мезотелиома и ее маркеры. По мере изучения материала других локализаций, опухолей другого гистогенеза выявляется, что данный антиген (скажем, кальретинин) содержится и в клетках рака молочной железы и легкого.

Это не значит, что надо отказаться от ИГХ-исследования. Во-первых, следует интерпретировать полученные результаты не форхчально, а в контексте клинических, общехморфологических данных. Во-вторых, всячески следует стрехмиться ставить ИГХ-реакции в виде широкой панели антигенов, которые, в определенной мере, выполняют функцию контроля по отношению друг к другу, и дополнять, в ряде случаев, биохимическими исследованиями крови. Например, при сомнительных ИГХ-результатах на хромогранин, альфа-фетопротеин и хорионический гонадотропин очень желательно определить эти вещества и в периферической крови. Важнейшим завоеванием современной онкоморфологии явилось внедрение в ежедневную практику методов молекулярно-генетических исследований. Прежде всего это относится к реакции флуоресцентной in situ гибридизации — FISH (fluorescent in situ hybridization) реакции.

Как видно из названия, метод основывается на трех принципиальных положениях. Для проведения реакции должно произойти связывание (гибридизация) флуоресцирующей специфической пробы в условиях фиксированного (in situ) субстрата — это цитогенетическая техника, которая используется для детекции и локализации присутствия или отсутствия специфических ДНК- последовательностей на хромосомах. Для этого метода используются флуоресцентные пробы, которые связываются только с теми участками хромосом, к которым у них имеется высокой степени общность последовательностей. Установление факта наличия или отсутствия связывания пробы с хромосомным участком происходит во флуоресцентном микроскопе.

Фабричным или лабораторным методом готовится проба, содержащая нужную последовательность нуклеотидов, и метится флуоресцентными красителями. Исследуемый материал, содержащий ДНК, подвергается обработке для частичного разрушения ее молекулы с целью разрыва двухцепочечной структуры и, тем самым, облегчения доступа к искомому участку гена. Пробу и исследуемый материал выдерживают при определенной температуре (обычно 37°С) несколько часов (ночь). За этот период проба должна связаться с ДНК — гибридизоваться. После этого излишек пробы отмывают и препарат изучают во флуоресцентном микроскопе, снабженном набором фильтров, сконструированных с учетом волн возбуждения и поглощения, характерных для тех флуоресцентных красителей, которые имеются в пробах.

При кажущейся простоте эта методика чрезвычайно сложна и требует очень детальной отработки всех компонентов и стадий подготовки материала. Стекла, на которых прикреплены срезы, мазки и т. д., для реакции должны быть тонкими и, самое главное, очень тщательно промытыми детергентами и храниться так, чтобы на них не оседала пыль. Последняя может содержать микробы, которые неспецифически поглощают красители и вызывают неустранимые слоновые свечения. Лучше хранить их в спирту (метиловом) и доставать по мере надобности.

Материалом для FISH-реакции служат парафиновые срезы тканей, мазки и отпечатки, в том числе мазки и осадки центрифугатов всевозможных жидкостей — моча, асцит, спинномозговая и амниотическая жидкости, сперма и др. FISH-реакция используется и для изучения структуры РНК, а также гетерологического чужеродного материала для человека — ДНК- и РНК-вирусов (Эпштайн-Барр, папилломатоза человека и др.).

Для проведения качественной реакции необходимо иметь четкие сведения о фиксации материала. Частицы тканей, фиксированных формалином, вполне пригодны для этих целей, но следует помнить, что длительность формалиновой фиксации отрицательно влияет на результаты реакции, однако и из длительно фиксированных тканей тоже можно получить убедительные результаты, главное знать об этом. Зная о том, сколько примерно фиксировали ткани в формалине, можно соответствующим образом изменить режим демаскировки.

FISH-реакция дает возможность регистрировать изменения в молекуле ДНК, произошедшие в результате увеличения копийности гена — амплификации, потери гена — делеции, изменения числа хромосом, а также качественные изменения — перемещения локусов генов как в пределах одной и той же хромосомы (инверсии), так и между двумя хромосомами — транслокации. Кроме традиционных, уже описанных методик реакции, как в исследовательскую, так и в диагностическую жизнь внедряются и новые специальные методические наработки и целые направления по изучению и диагностике геномных нарушений. Из этих направлений следует отметить следующие.

Сравнительная геномная гибридизация. Этот метод позволяет провести своего рода скрининг всего генома без предварительного знания, в каких участках могут быть нарушения. Его огромным достоинством является отсутствие необходимости получения метафазных хромосом исследуемой ткани и клеток, достаточно иметь ДНК исследуемого материала.

Применение FISH-реакции при отдельных опухолевых заболеваниях у детей
Хронический миелолейкоз. Это первое опухолевое злокачественное заболевание человека, связь которого с цитогенетическим нарушением была доказана убедительно. В I960 г. два ученых из США P. Nowell и D. Hungerford открыли наличие у больных с хроническим миелолейкозом специфической хромосомы, названной по месту проводимых исследований — филадельфийской хромосомой (Ph). В настоящее время установлено, что генез филадельфийской хромосомы связан с транслокацией, происходящей между 9-й и 22-й хромосомой. При реципрокной транслокации на 22-й хромосоме формируется новый ген, кодирующий белок, обладающий тирозинкиназной активностью и определяющий злокачественность процесса. Идентификация этого слитного гена является задачей реакции и входит в состав рутинных наборов диагностики хронического миелолейкоза. При этом важное значение приобрел не только качественный, но и количественный учет ядер с транслокацией t(9;22)(q34;qll), поскольку динамика числа таких ядер используется для оценки эффективности терапии, а также для раннего выявления рецидива болезни (молекулярный рецидив). Эту реакцию можно ставить на мазках крови, на пунктатах костного мозга и даже (редко) на срезах. Поиски можно вести как на интерфазных ядрах, так и метафазных пластинках. Обычно в лабораторию доставляют пунктаты костного мозга.

Nmmyc (MYCN). Nmyc является представителем семейства генов туе (myelocytomatosis viral related oncogene) и кодирует локализующийся в ядре белок, относящийся к транскрипционному фактору. Находится этот ген на коротком плече второй хромосомы (2р24.1). Особое значение он приобрел после того, как в работах М. Schwaba, H.Е. Warmusa и J.M. Bishopa была выявлена роль продукта этого гена в прогнозе нейробластомы. Ген MYCN ахчплифицирован прихмерно в 20-25% нейробластом, чаще на поздних стадиях, и является прогностически неблагоприятныхм фактором, обусловливающим химиорезистентность опухолевых клеток. До сих пор нет четких количественных параметров для оценки степени амплификации гена Nmyc. Вначале выделяли амплификацию низкой и высокой степени, принимая за ахмплификацию наличие даже трех лишних копий гена. В настоящее время склоняются к числу 10 (при 2 центромерных сигналах), но, на наш взгляд, в амплифицированнохм состоянии сигналов должно быть еще больше. Небольшое число копий гена Nmyc может быть не связано с амплификацией этого гена. Во-первых, иногда формируются изохромосомы 2р, а во-вторых, происходят несбалансированные транслокации короткого плеча второй хромосомы.

Несколько моментов, которые должны быть учтены специалистом, проводящим FISH-реакцию при нейробластоме.
I. Ганглионейрома не сопровождается амплификацией гена Nmyc, поэтому не является объектом изучения, хотя некоторые клиницисты по незнанию настаивают на этом.
2. Очень осторожно надо оценивать результаты исследования ганглионейробластомы. Микроскопическая структура этого варианта чрез¬вычайно пестрая и требует детального изучения каждого случая на препаратах, окрашенных гематоксилином и эозином. Регистрировать сигналы следует в мелких округлых ядрах незрелых клеток. Более крупные клетки, созревающие в ганглиоциты, проходят стадию полиплоидизации и без строгого учета числа центромерных сигналов могут быть ошибочно расценены как клеточные элементы с амплификацией гена Nmyc.
3. В случае динамического наблюдения за больными желательно провести FISH-реакцию на материале, полученном на разных этапах лечения пациента — рецидивах, метастазах. Анализ состояния гена Nmyc в динамике позволяет более объективно оценить прогностическое значение этого фактора, что, самое главное, должно производиться в контексте всей микроскопической картины болезни на конкретном ее этапе. Имеются наблюдения, когда различалось число копий гена Nmyc в рецидивных опухолях и метастазах по сравнению с первичным очагом болезни.

В клиническом аспекте следует также помнить, что не всегда степень амплификации (вплоть до ее отсутствия) коррелирует с прогнозом. Во многом такие расхождения обусловлены степенью экспрессии гена на уровне РНК или белка. Для установления прогноза при нейробластоме используется и другая реакция, выявляющая делецию короткого плеча 1-й хромосомы (1рЗб). Результат этой делеции прогностически весьма неблагоприятен, поскольку предположительно связан с потерей пока не идентифицированного гена-супрессора, локализующегося в этом участке. На тканевых срезах результаты не очень демонстративны (нужно сосчитать большое число не перекрывающих друг друга ядер). В тех случаях, когда это возможно, лучше проводить реакцию на мазках-отпечатках. Особое значение придают результатам этой реакции для предсказания рецидивов опухоли. Проба на увеличение числа копий 17q, также характерного для нейробластомы, на практике применяется редко.

Транслокации при саркомах мягких тканей
Синовиальная саркома — одна из часто встречающихся мягкоткан- ных опухолей человека. Название этого новообразования является чисто историческим, поскольку связь опухоли с синовиальной оболочкой в настоящее время окончательно отвергнута. Более того, синовиальная саркома — единственная опухоль, нозологическая спецификация которой происходит с учетом генетических нарушений, в частности специфической транслокации между 18-й и женской половой хромосомой t (X;18)(pll;qll).

При синовиальной саркоме в транслокации участвуют геи SYT, локализующийся на длинном плече 18-й хромосомы, и гены SSX1 (варианты SSX2, SSX4), являющиеся представителями семейства генов, находящиеся на X хромосоме и отличающиеся друг от друга точкой разрыва. Слитный химерный ген, формирующийся при транслокации, кодирует белок, являющийся регулятором транскрипции, который активирует протоонкогены или ингибирует супрессоры. Клинико-биологические свойства синовиальной саркомы определяются продуктом новообразованного химерного гена. Доказано, что морфологический вариант синовиальной саркомы зависит от варианта гена SSX, участвующего в транслокации. При наличии в слитном гене SSX1 опухоль обычно имеет бифазное строение. В монофазной опухоли возможны любые варианты гена SSX. Транслокация встречается в 90% случаев. В крупных лабораториях для диагностики синовиальной саркомы используют метод RT-PCR, что значительно повышает точность диагностики.

Саркома Юмига является мелкоклеточной круглоклеточной саркомой, входящей, совместно с ПНЭО, круглоклеточной десмопластической опухолью и другими опухолями, в семейство саркомы Юинга. Для всех указанных новообразований характерна транслокация t(ll;22)(q24;ql2), встречающаяся в 85% случаев. При этой транслокации происходит слияние гена EWS, локализующегося на 22-й хромосоме, с геном FLI1, находящегося на 11-й хромосоме. Эта транслокация реципрокная, и дериватный ген может формироваться на обеих хромосомах. Белок, кодируемый дериватным геном, имеет множество функций, хотя основная заключается в активации транскрипционной активности. Следует отметить, что ген EWS транслоцируется в 90% случаев с FLI1, но в остальных случаях может поменяться местами и с другими генами, например ERG, ETV1, FEV, E1AF. Проба на эту транслокацию чрезвычайно точна и чувствительна. Реакцию можно ставить на срезах, на мазках, достаточно даже иметь в мазке пару десятков клеток.

Иногда в ядрах, наряду с типичной картиной транслокации, можно увидеть большое число оранжевых сигналов. Это — амплифицированные участки проксимального отдела гена EWS. Данная амплификация придает своеобразие как клинической симптоматике, так и чувствительности саркомы Юинга к химиотерапии. Эти опухоли резистентны к классическим химиотерапевтическим схемам и требуют более энергичной терапии. Часто их рентгенологическая семиотика лишена типичных проявлений в виде луковичного периостоза и больше похожа на метастатическое поражение кости. Наличие указанной амплификации необходимо обязательно отметить в ответе патолога.

FISH и герминогенные опухоли. Чрезвычайно своеобразным признаком, ассоциированным с герминогенными опухолями детей, является патология хромосомы 12. Нарушения этой хромосомы при герминогенных опухолях носят двоякий характер. Могут формироваться изохромосомы 12, с удвоением короткого плеча и одновременной потерей длинного плеча (il2p), возможна также амплификация генетического материала короткого плеча этой хромосомы. Первоначально считалось, что наличие этих нарушений свидетельствует о высокой степени злокачественности герминогенных опухолей, например, повышенной склонности к метастазированию семиномы или дисгерминомы. Большую диагностическую ценность имеет обнаружение названных нарушений в ткани яичка в структурах подозрительных на рак in situ яичек. В последнее время делаются попытки использования выявления нарушений на 12-й хромосоме для дифференциальной диагностики герминогенных и негерминогенных опухолей. Тем не менее эта проба пока еще не вошла в ежедневную клиническую практику Причин этому несколько. Во-первых, клиницисты не очень хорошо знакомы с данными цитогенетическими нарушениями. Во-вторых, коммерческая проба признается не всеми специалистами, а предпочтение отдается синтезированным в лаборатории пробам, что затрудняет последующее стандартизированное сравнение результатов, и, наконец, клинический аспект разницы двух феноменов — формирования изохромосомы 12р и амплификации генетического материала на коротком плече этой хромосомы не до конца ясен. По состоянию вопроса на текущий момент считается, что изначально наступает амплификация генетического материала на коротком плече хромосомы 12, позже теряется длинное плечо и удваивается короткое плечо. Таким образом, оба процесса являются как бы звеньями одной и той же цепи. Действительно, во многих гермино-генных опухолях, например, в семиноме у одного и того же индивидуума, выявляются оба типа нарушений.

Использование этой пробы кажется перспективным, однако требуется накопление определенного числа клинических наблюдений с последующим анализом отделенных результатов лечения этих больных. Следует помнить также о том, что эта проба используется для диагностики врожденной патологии у детей с синдромом Pallister-Killiana (тетрасомии 12-й хромосомы с формированием изохромосомы 12р).

Диагностика пола необходима не только для характеристики пограничных состояний у больных с герминогенными новообразованиями гонад. В последнее время появилась проба на участок SRY (sex determining region) на Y-хромосоме. Этот участок содержит ген, кодирующий материал, отвечающий за развитие мужского организма. Изучение этого участка является перспективным для анализа тех новообразований полового тяжа, в которых степень и направленность дифференцировки опухолевых клеток на уровне световой микроскопии не ясна. Пробы на половые хромосомы можно использовать и для точной характеристики клона трансплантированных клеток костного мозга (при разнополом доноре и реципиенте).

В заключение следует отметить, что морфологическая диагностика опухолей — чрезвычайно сложный и ответственный процесс, успешная реализация которого возможна не только с применением широкого спектра классических и современных методик, но и тесным поэтапным контактом патологоанатома и клинициста, при котором происходит как взаимное обогащение необходимой информацией, так и контроль оценки получаемых результатов.


Оцените статью: (10 голосов)
4 5 10
Статьи из раздела Онкология на эту тему:
Генетические аспекты детской онкологии





Новые статьи

» Ожирение
Ожирение
Основные принципы лечения ожирения: • низкокалорийная диета; • изменение образа жизни; • дозированные физические нагрузки; • физиотерапия и иглорефлексотерапия; • лекарственная терапия (препараты... перейти

» Плоскостопие
Плоскостопие
Плоские стопы делят на врожденные (около 5%) и приобретенные (до 95%). Врожденное плоскостопие встречается очень редко и связано с костными искривлениями вследствие неправильного положения плода, в ре... перейти

» Сколиоз
Сколиоз
Лечебная физическая культура - важнейшее средство в комплексной терапии сколиоза, которая направлена на решение следующих задач: • создание физиологических предпосылок для восстановления правильного ... перейти

» Нарушение осанки
Нарушение осанки
Путь к формированию правильной осанки и направленной коррекции ее нарушений начинается с методически правильно выполненного осмотра и, при необходимости, проведения углубленного обследования. Это обус... перейти

» Детский церебральный паралич
Детский церебральный паралич
Основным средством лечебной физкультуры при детском церебральном параличе являются специально подобранные упражнения в соответствии с задачами лечебно-восстановительной работы, определяемые состоянием... перейти

» Хроническая почечная недостаточность
Хроническая почечная недостаточность у детей - это неспецифический синдром, развивающийся вследствие необратимого снижения почечных гомеостатических функций при любом тяжелом прогресс... перейти

» Тубулоинтерстициальный нефрит и интерстициальный нефрит
Тубулоинтерстициальный нефрит и интерстициальный нефрит
Тубулоинтерстициальный нефрит или интерстициальный нефрит - острое или хроническое неспецифическое абактериальное, недеструктивное воспаление интерстициальной ткани почек, сопровождающееся вовлечением... перейти