Растенок - все о здоровье детей и будующих мам.
ГлавнаяНовостиКонтакты
 

Молекулярно-генетические методы диагностики инфекции Helicobacter pylori

Молекулярно-генетические методы диагностики инфекции Helicobacter pylori
Для проведения полимерной цепной реакции с целью выявления Helicobacter pylori используется стандартное оборудование и набор ингредиентов для определения ДНК возбудителя. Поскольку практически все штаммы Helicobacter pylori обладают уреазной активностью, наиболее универсально определение уреазы (Ure A или В). Метод позволяет обнаружить не только активную форму микроорганизма, но и кокковую. С помощью полимерной цепной реакции стало возможным определение видоспецифического фрагмента ДНК, что позволяет типировать штамм бактерии, оценить свойства микроорганизма, в частности его токсигенность, по обнаружению генов CagA, VacA, IceA, BabA - это может иметь важное прогностическое значение в оценке факторов риска канцеро- и ульцерогенеза и подборе эрадикационных схем. Определение мутаций 23S рибосомальной РНК позволяет с высокой точностью говорить о резистентности штамма Helicobacter pylori к кларитромицину. Проведение полимерной цепной реакции непосредственно в биоптате, без предварительного посева, сокращает время исследования до нескольких часов.


На ценность метода оказывают значительное влияние условия взятия, хранения и транспортировки биоптатов. Чувствительность полимерной цепной реакции в биоптате колеблется от 81 до 91%, в то время как специфичность приближается к 100%. Полимерная цепная реакция в биоптатах слизистой оболочке желудка выполнена нами у 185 больных, чувствительность метода составила 77,6%, специфичность - 89,1%Интерес представляет новая молекулярно-генетическая техника, так называемая флюоресцентная гибридизация in situ (FISH), предложенная K. Trebesius и соавт., не требующая культивирования Helicobacter pylori и позволяющая совершенствовать выявление микроорганизма методом обработки срезов мечеными флюоресцирующими нуклеотидами. Нуклеотиды могут быть связаны либо с 16S рибосомальной РНК (для идентификации Helicobacter pylori), либо с 23S рибосомальной РНК (для определения резистентности к макролидам). После гибридизации бактерии обнаруживают при флюоресцентной микроскопии, результаты могут быть получены в течение 3 ч.


Метод имеет высокую чувствительность (91%) и специфичность (100%) и позволяет выявить инвазию смешанными штаммами, обнаруженную у 15% больных.

Гистологический метод дает возможность не только обнаружить бактерии, но и определить их расположение, наблюдать взаимоотношение с тканями «хозяина», оценить характер патологического процесса в слизистой оболочке, наличие и выраженность воспаления, атрофии, метаплазии. Именно поэтому метод признан «золотым стандартом» в диагностике Helicobacter pylori-инфекции. Для элективной окраски Helicobacter pylori применяют различные методики. В мире наиболее распространена специфическая окраска серебрением по Вартину-Старри, отличающаяся высокой специфичностью и чувствительностью. По мнению Л.И. Аруина и соавт., наиболее чувствительной оказалась окраска акридиновым оранжевым (85%) и красителем Гимзы (79%), несколько меньше - чувствительность окраски по Граму. В настоящее время в отечественной практике чаще используется окраска азур-эозином по Гимзе как достаточно информативная и дешевая.

Исследование, проведенное И.А.


Морозовым, В.Н. Матушевской и соавт., показало довольно низкую чувствительность гистологического метода (79,7%) в сравнении с изучением мазков-отпечатков и уреазным тестом. Возможно, это обусловлено, с одной стороны, особенностями самого микроорганизма, обитающего в слое покрывающей эпителий желудка слизи, он не всегда плотно адгезирован к эпителию, поэтому легко вымывается при подготовке биоптатов к исследованию, с другой стороны, и сам слизистый слой легко отмывается в процессе подготовки биоптата. Для ликвидации этого недостатка И.А. Морозов предложил защищать поверхность биоптата нанесением агарового геля (0,85-1%), что позволяет сохранить поверхностный слой слизи и бактерии в нем. Проведенное нами исследование трех биоптатов слизистой оболочке желудка у каждого из 501 больного показало, что вероятность морфологического обнаружения Helicobacter pylori возрастает при множественной биопсии, чувствительность гистологического метода составила 88,8%, специфичность - 98%.Биохимический метод обнаружения Helicobacter pylori в биоптате основан на высокой уреазной активности Helicobacter pylori. В настоящее время существуют различные модификации уреазных тестов - преимущественно на жидкой или гелевой основе, они просты в использовании, не требуют дополнительных исследований и позволяют с достаточно высокой точностью идентифицировать Helicobacter pylori по изменению цвета индикатора в результате защелачивания среды аммиаком, выделившимся в процессе гидролиза мочевины микробной уреазой. Большинство тестов содержат в качестве индикатора феноловый красный и изменяют свой цвет с желтого на красный, время их срабатывания от 10 до 20 мин, они отличаются высокой чувствительностью (75-95%) и специфичностью (100%). Однако следует учитывать, что при желудочном кровотечении чувствительность уреазных тестов снижается примерно на 25%.

К преимуществам всех уреазных тестов следует отнести простоту выполнения и быстроту, к недостаткам - косвенную, непрямую сущность метода, обнаружение не Helicobacter pylori как такового, а лишь его уреазной активности. При невысокой степени обсемененности ткани и суммарная уреазная активность может быть невысокой, поэтому тест может дать ложноотрицательный результат. Именно поэтому, по мнению S. Madani и соавт., у детей уреазный тест не имеет столь же высокой чувствительности, как у взрослых. Наряду с уреазопозитивными изредка встречаются уреазонегативные штаммы Helicobacter pylori, их нельзя обнаружить уреазным тестом. С другой стороны, присутствие в ткани большого количества транзиторной флоры, среди которой могут встречаться менее активные уреазопродуценты (протей, псевдомонады, стрептококки и др.), может дать ложноположительный результат теста, особенно при длительной 24-часовой экспозиции в термостате. В связи с этим в настоящее время используются лишь «холодные» тесты, проводимые при комнатной температуре без инкубации в термостате, что позволяет получить положительный ответ лишь на уреазу, накопленную в ткани (тканевую), специфичную для Helicobacter pylori, а не вырабатываемую бактериями в процессе культивирования (бактериальную).Удачным примером «холодного» теста служит быстрый уреазный тест на основе твердого волокнистого носителя - Хелпил-тест, разработанный нами в 1996 г. Тест содержит в качестве индикатора бромтимоловый синий с рН перехода от 6 до 7,6. Использование индикатора с несколько меньшим значением рН перехода позволяет зафиксировать в реакционной среде меньшее количество свободного аммиака, а следовательно, и меньшее количество уреазы, т. е. повысить чувствительность теста. Биохимическая реакция происходит на ограниченном пространстве под биоптатом и в непосредственной близости от него, что делает сопоставимым количество уреазы и реакционной среды, это также повышает чувствительность метода.

Для оценки уреазной активности биоптат, полученный в ходе эндоскопического исследования, помещают на тест-билет и в течение 3 мин наблюдают появление индикационного эффекта - синего пятна на желтом фоне (см. рис. 10-3 на цветной вклейке). О степени уреазной активности свидетельствует скорость появления пятна, его диаметр и интенсивность окраски. Окрашивание теста под биоптатом шириной до 1 мм расценивается как I-я степень, от 1 до 2 мм - II степень и более 2 мм - III степень уреазной активности. При III степени окрашивание появляется уже на 1-й мин. Индикационный эффект появляется непосредственно в ходе биохимической реакции разложения мочевины уреазой Helicobacter pylori. Поскольку тест-билет обладает капиллярными сорбционными свойствами, он абсорбирует жидкость из биоптата, не окрашивая последний, поэтому биоптат может быть использован для дальнейшего гистологического или бактериологического исследования.

Гигроскопичный материал теста адсорбирует жидкость из биоптата, лежащего на нем, поэтому биохимическая реакция происходит на ограниченном пространстве под ним, что делает сопоставимым количество уреазы и реакционной среды и повышает чувствительность метода. Использование в качестве индикатора бромтимолового синего с более низкой рН перехода позволяет зафиксировать в реакционной среде меньшее количество аммиака, а следовательно, и уреазы, повысить чувствительность метода. Тест отличается дешевизной и быстротой (1-3 мин) и дает возможность использовать один и тот же биоптат для дальнейшего гистологического исследования, такими свойствами не обладает ни один из существующих ныне уреазных тестов. Чувствительность Хелпил-теста у детей, по нашим данным, составляет 87,3%, специфичность - 93,6%. Сочетание уреазного теста с последующим гистологическим исследованием способно приблизить точность диагностики к 100%. Нами установлена умеренная положительная связь (коэффициент корреляции - 0,632, p <0,05) между степенью уреазной активности, по результатам Хелпил-теста, и степенью колонизации HP слизистой оболочки желудка, по данным гистологического исследования. Можно сделать вывод, что Хелпилтест отражает степень колонизации Helicobacter pylori.


Оцените статью: (7 голосов)
4.14 5 7
Статьи из раздела Инфекции на эту тему:
Инвазивные методы диагностики инфекции Helicobacter pylori
Неинвазивные методы диагностики инфекции Helicobacter pylori





Новые статьи

» Ожирение
Ожирение
Основные принципы лечения ожирения: • низкокалорийная диета; • изменение образа жизни; • дозированные физические нагрузки; • физиотерапия и иглорефлексотерапия; • лекарственная терапия (препараты... перейти

» Плоскостопие
Плоскостопие
Плоские стопы делят на врожденные (около 5%) и приобретенные (до 95%). Врожденное плоскостопие встречается очень редко и связано с костными искривлениями вследствие неправильного положения плода, в ре... перейти

» Сколиоз
Сколиоз
Лечебная физическая культура - важнейшее средство в комплексной терапии сколиоза, которая направлена на решение следующих задач: • создание физиологических предпосылок для восстановления правильного ... перейти

» Нарушение осанки
Нарушение осанки
Путь к формированию правильной осанки и направленной коррекции ее нарушений начинается с методически правильно выполненного осмотра и, при необходимости, проведения углубленного обследования. Это обус... перейти

» Детский церебральный паралич
Детский церебральный паралич
Основным средством лечебной физкультуры при детском церебральном параличе являются специально подобранные упражнения в соответствии с задачами лечебно-восстановительной работы, определяемые состоянием... перейти

» Хроническая почечная недостаточность
Хроническая почечная недостаточность у детей - это неспецифический синдром, развивающийся вследствие необратимого снижения почечных гомеостатических функций при любом тяжелом прогресс... перейти

» Тубулоинтерстициальный нефрит и интерстициальный нефрит
Тубулоинтерстициальный нефрит и интерстициальный нефрит
Тубулоинтерстициальный нефрит или интерстициальный нефрит - острое или хроническое неспецифическое абактериальное, недеструктивное воспаление интерстициальной ткани почек, сопровождающееся вовлечением... перейти